此前,艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)通過(guò)多期軟文與視頻,分析了生物制劑中緩沖體系的重要作用及篩選考量,歡迎您前往艾偉拓公眾號(hào)對(duì)之前的幾篇文章進(jìn)行回顧。
本期,艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)延續(xù)這一話題,對(duì)抗體等蛋白制劑在純化工藝中的緩沖體系選擇進(jìn)行討論。
抗體等蛋白類生物制劑的聚集,可能會(huì)影響產(chǎn)品的潛在免疫原性,其電荷異質(zhì)性也可能影響treatment的安全性和有效性。
此前,我們主要將目光聚焦于成品制劑的穩(wěn)定性。但值得注意的是,抗體蛋白在加工純化等工藝過(guò)程中的穩(wěn)定性也需要給予關(guān)注。為此,艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)結(jié)合一篇來(lái)自印度理工學(xué)院的研究論文,對(duì)抗體蛋白純化主要工藝步驟中的緩沖體系選擇進(jìn)行討論。
01 蛋白A親和層析
蛋白A親和層析是抗體產(chǎn)品純化工藝中普遍存在的捕獲步驟,Protein A的成功是由于其特別而重要的能力,可以有效地捕獲抗體蛋白產(chǎn)物(回收率為95-99%),同時(shí)去除絕大多數(shù)宿主細(xì)胞雜質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸)。
蛋白A的洗脫通常在低pH下進(jìn)行,隨后在低pH下進(jìn)行病毒失活。然而,低pH與抗體蛋白的聚集有關(guān),這是由于Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致洗脫過(guò)程中可溶性高分子量聚集體和/或不溶性沉淀物的增加。
使用SEC(分子排阻色譜)分析抗體聚集(圖1A)。可以看出,在4°C和30°C下,即使在無(wú)鹽緩沖液中保存長(zhǎng)達(dá)7天,抗體蛋白聚集程度的增加也很小。only的例外是檸檬酸緩沖液,即使在沒(méi)有鹽的情況下也能觀察到相當(dāng)數(shù)量的聚集。
鹽的加入(離子強(qiáng)度~0.2 ~ 0.3 mol/L)幾乎在所有情況下都能突出提高抗體蛋白聚集程度,在30℃時(shí)效果更明顯。
由此可以得出初步結(jié)論:
① 鹽和高溫的結(jié)合導(dǎo)致抗體蛋白聚集性突出增加;
② 與醋酸鹽和甘氨酸緩沖液相比,檸檬酸緩沖液傾向于導(dǎo)致更高的蛋白聚集,特別是在高溫下。
因此,建議在低溫條件下進(jìn)行蛋白A親和層析并保存層析產(chǎn)物,如果保持在較高的溫度下,則產(chǎn)物保持時(shí)間應(yīng)限制在幾個(gè)小時(shí)內(nèi),盡快進(jìn)入下一個(gè)純化處理步驟。
02 陽(yáng)離子交換層析
對(duì)于抗體類藥物而言,蛋白聚集是較大的不穩(wěn)定性來(lái)源。此外,電荷異質(zhì)性也會(huì)導(dǎo)致抗體蛋白的產(chǎn)品異質(zhì)性。
離子交換層析廣泛應(yīng)用于抗體蛋白純化工藝,研究表明該步驟中電荷異質(zhì)性是影響抗體蛋白穩(wěn)定性的主要因素。圖3A為該研究選擇的不同緩沖條件下抗體蛋白電荷異質(zhì)性隨時(shí)間的變化數(shù)據(jù)。
從總體上看,隨著時(shí)間的推移,主峰含量呈下降趨勢(shì),其中磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)的下降幅度較大,磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)的下降幅度較小。同時(shí),鹽的加入使主峰含量降低。
對(duì)于醋酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液,發(fā)現(xiàn)主峰含量在1周內(nèi)的變化為小于2%。
在pH為6.5時(shí),磷酸鹽緩沖液中抗體蛋白的主峰含量發(fā)生了明顯變化,從圖3B中可以看出,時(shí)間和pH值對(duì)帶電變異體的形成都起著重要的作用。
從圖3A中也可以看出,在pH為7.5時(shí),磷酸鹽緩沖液中抗體蛋白的主峰含量變化可以忽略不計(jì),而在pH為6.5時(shí),相同的緩沖液發(fā)生了突出變化。在pH值為6.5時(shí)觀察到的一個(gè)有趣現(xiàn)象是,隨著時(shí)間的推移,主峰含量先降低后增加。
03 陰離子交換層析
圖4A顯示了所選擇的不同緩沖條件下(Tris-HCl pH 7.2和Tris-HCl pH 8)主峰含量隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)??梢钥闯?,在pH 7.2時(shí),變化不突出。
然而,在pH值為8時(shí),抗體蛋白產(chǎn)物的電荷異質(zhì)性發(fā)生了相當(dāng)大的變化,在較高的溫度下變化更大。鹽的存在對(duì)主峰含量的影響很小。
圖4B展示了統(tǒng)計(jì)建模的結(jié)果??梢钥闯?,與陽(yáng)離子交換層析一樣,pH和時(shí)間對(duì)確定主峰含量起關(guān)鍵作用。
與之前一樣,用pH為8的Tris-HCl緩沖液對(duì)數(shù)據(jù)構(gòu)建等高線圖??梢钥闯?,隨著溫度的升高,設(shè)計(jì)空間減小。允許的離子強(qiáng)度隨著保持時(shí)間的增加而降低,直到100 h后超過(guò)允許的極限。在30℃時(shí),離子強(qiáng)度不建議大于0.05,純化中間產(chǎn)品保持時(shí)間不建議超過(guò)60h,以避免主峰含量低于限度。
04 討論
低pH導(dǎo)致抗體蛋白聚集。在遠(yuǎn)離pI的低pH條件下,抗體蛋白是高電荷的,導(dǎo)致電荷排斥,這使蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定,這種結(jié)構(gòu)擾動(dòng)會(huì)促進(jìn)抗體的展開(kāi)介導(dǎo)聚集。這是常規(guī)蛋白A層析和病毒滅活過(guò)程步驟的條件下抗體蛋白突出聚集的主要原因。
在高pH (pH 8,接近蛋白的pI)的條件下,觀察到抗體蛋白的電荷異質(zhì)性增加。主峰含量的下降是由于酸性變體的增加導(dǎo)致。天冬氨酸殘基的脫酰胺化是導(dǎo)致抗體降解和療效下降的常見(jiàn)原因。這也是電荷異質(zhì)性在離子交換層析步驟中突出影響蛋白穩(wěn)定性的主要原因。
05 小結(jié)
該研究發(fā)現(xiàn),蛋白聚集是蛋白A親和層析和病毒失活步驟較大允許保持時(shí)間的主要決定因素,而電荷異質(zhì)性的變化決定了陽(yáng)離子交換和陰離子交換步驟的較大允許保持時(shí)間。這其中,適宜緩沖體系的選擇對(duì)抗體蛋白在純化過(guò)程中的穩(wěn)定發(fā)揮著很大的作用。
在常見(jiàn)的蛋白A親和層析條件下,高離子濃度和高溫會(huì)導(dǎo)致抗體蛋白聚集突出增加;緩沖體系選擇方面,與醋酸鹽和甘氨酸緩沖液相比,檸檬酸緩沖液傾向于導(dǎo)致更高的蛋白聚集。而在離子交換層析中,離子強(qiáng)度、溫度及pH值對(duì)抗體蛋白的電荷異質(zhì)性有較大影響。
總而言之,除了制劑中的緩沖體系,還應(yīng)關(guān)注抗體等蛋白制劑在蛋白純化等過(guò)程工藝步驟中的緩沖體系選擇,不同的緩沖體系(種類,pH,離子濃度)會(huì)對(duì)抗體蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生不同程度的影響,直接影響中間產(chǎn)物的較大允許保持時(shí)間,進(jìn)而影響抗體制劑的穩(wěn)定性與treatment效果。
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